1. 重组DNA分子的基本技术
    1. 限制性内切核酸酶
      1. 粘性末端
        1. 沿中心轴线两侧切开
      2. 平末端
        1. 沿中心轴线切开
    2. DNA连接酶
      1. E.coliDNA连接酶
        1. 只能连接粘性末端
      2. T4DNA连接酶
        1. 粘性末端与平末端（效率较低）均可以
    3. 载体
      1. 条件
        1. 有一至多个限制酶切割位点
          1. 供外源DNA分子插入其中
        2. 有复制原点，能在细胞中稳定存在和复制
          1. 随受体DNA同步复制
        3. 有特殊的标记基因
          1. 便于重组DNA分子的筛选
        4. 没有毒害作用
          1. 避免受体细胞受到损伤
    4. DNA的粗提取与鉴定
      1. 原理
        1. DNA不溶于95%的冷酒精，但某些蛋白质溶于酒精
      2. 原料
        1. 鸡血，菜花等
        2. 不可以用哺乳动物成熟红细胞，无细胞核
      3. 步骤
        1. ①研磨液，洗涤剂
          1. 作用
          2. 洗涤剂破坏细胞膜，洗涤剂加入植物材料进行研磨，获取研磨液
        2. ②在上清液加入95%的冷酒精，卷起丝状物离心，将沉淀物晾干
        3. ③加入2mol/LNaCL溶液，加入二苯胺试剂，沸水加热，冷却后观察蓝色。
    5. 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键，主要从原核生物中提取。
    6. 连接两个DNA片段，不同于DNA聚合酶：将单个脱氧核苷酸连接到DNA子链上
  2. 基因工程的基本操作程序
    1. Step1-目的基因的筛选与获取
      1. 筛选合适目的基因的方法
        1. 构建基因文库
          1. 基因组文库
          2. CDNA文库（外显子）
      2. 获取和扩增目的基因的方法
        1. PCR
          1. 原料
          2. TaqDNA聚合酶
          3. 四种脱氧核苷酸
          4. 两种引物
          5. 作用
          6. 定位目的基因，与模版链结合，并未子链的延伸提供起点
          7. DNA母链
          8. 含Mg2+的缓冲液
          9. 扩增过程
          10. 变性（90）
          11. 双链解聚为单链
          12. 复性（退火）（50）
          13. 两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
          14. 延伸
          15. 四种脱氧核苷酸在Taq酶作用下根据碱基互补配对连成子链
          16. 鉴定
          17. 方法
          18. 琼脂糖凝胶电泳
          19. 误差分析
          20. 出现非特异性扩增条带
          21. 复性温度低（与氢键有关）
          22. Mg2+浓度过高
          23. PCR循环次数过多
          24. 未出现特异性扩增条带
          25. 变性温度低
          26. Mg2+浓度过低
    2. Step2-基因表达载体的构建（核心）
      1. 条件
        1. 启动子
          1. RNA聚合酶识别和结合的位点
        2. 终止子
        3. 复制原点
        4. 标记基因
        5. 目的基因
    3. Step3-将目的基因导入受体细胞
      1. 花粉管通道法
        1. 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液注入子房中
        2. 或在植物受粉后剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面上，是目的基因借助花粉管通道进入囊胚
      2. 处理受体细胞
        1. 原核细胞
          1. Ca2+处理法
        2. 动物受精卵
          1. 显微注射
      3. 农杆菌转化法
        1. 转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
        2. 农杆菌：主要侵染双子叶植物和裸子植物
          1. 原理
          2. 侵染植物细胞后，将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞的染色体DNA上
          3. 处理原核细胞
          4. Ca2+，使细胞处于感受态
    4. Step4-目的基因的检测与鉴定
      1. 分子水平
        1. PCR等技术
          1. 检测受体细胞染色体DNA上是否插入目的基因
          2. 检测目的基因是否转录出mRNA
        2. 抗原-抗体杂交技术
          1. 检测目的基因是否翻译成蛋白质
      2. 个体生物学水平
        1. 抗虫接种实验等
      3. 答题时要回答基因的具体名字，如Bt基因
  3. 基因工程的应用
    1. 农牧业
    2. 医药卫生
      1. 原理
        1. 将药用蛋白基因与乳腺特异表达的启动子结合，显微注射到动物受精卵。这类动物是乳腺生物反应器。
    3. 食品工业
  4. 蛋白质工程的原理和应用
    1. 原理
      1. 改造或合成基因
    2. 基本思路
      1. 从预期蛋白质功能出发—设计预期的蛋白质结构—推测氨基酸序列—找到并改变核苷酸序列或合成基因—获得所需蛋白质
  5. 二代基因工程难度大，因为蛋白质复杂的高级结构
  6. PCR专题
    1. 重叠延伸PCR技术
    2. RT-PCR技术
    3. 实时荧光PCR技术
      1. 荧光强度
        1. 与扩增次数和模版RNA数量有关
      2. 灵敏度
        1. 引物和探针
      3. n次循环消耗的探针数量
    4. 传统PCR
      1. 获得的目的基因
      2. 消耗的引物